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論文資訊
- 類型：已發表論文
- 日期：2022-09-02
摘要
分子量 < 25 kDa 的蛋白質參與主要生物過程，例如核醣體形成、壓力適應（例如溫度降低）和細胞週期控制。儘管它們很重要，但標準蛋白質體研究中較小蛋白質的覆蓋範圍相當稀疏。在這裡，我們研究了影響識別覆蓋率和有效性的生化和質譜參數。低分子量 (LMW) 蛋白質的代表性不足可能是由於胰蛋白酶消化形成的蛋白水解勝肽數量較少，以及它們在蛋白質分離和濃縮/脫鹽過程中容易流失。在大腸桿菌 LMW 蛋白質組的系統研究中，總共鑑定了 455 個 LMW 蛋白（SwissProt 蛋白資料庫中列出的 1,672 個 LMW 蛋白的 27%），相當於已知胞質 LMW 蛋白的 62% 的覆蓋率。在這些蛋白質中，有 93 種尚未進行功能分類，其中 5 種先前尚未在蛋白質層面上確認。在本研究中，研究了蛋白質萃取（尿素或 TFA）、蛋白水解消化（單獨使用胰蛋白酶和 AspN 作為內切蛋白酶）和蛋白質分離（基於凝膠或非凝膠）的影響。與僅使用尿素裂解緩衝液、凝膠內分離和胰蛋白酶消化的標準程序相比，補充使用 TFA 進行萃取或使用內切蛋白酶 AspN 進行蛋白水解，可以分別鑑定額外的 72 種 (32%) 和 51 種蛋白質 (23%)。關於使用 LTQ Orbitrap 質譜儀進行的質譜分析，比較了使用線性離子阱 (IT) 或 Orbitrap 作為分析儀的碰撞誘導碎裂（CID 和 HCD）和電子轉移解離。 IT-CID 被發現具有最佳的識別率，而 IT-ETD 在 LMW 蛋白質組覆蓋率方面提供了幾乎相當的結果。 IT-CID 和 IT-ETD 鑑定的蛋白質之間的高度重疊允許使用這種正交片段化技術驗證 75% 的鑑定蛋白質。此外，還引入並檢驗了一種利用 RNAcode 程序來評估和提高蛋白質資料庫完整性的新方法。