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論文資訊
- 類型：已發表論文
- 日期：2024-03-12
摘要
無細胞表現（CFE）系統是建構合成細胞的主要平台之一。一個主要缺點是跨物種的無細胞系統的正交性。為了產生與最近建立的最小細胞構建體相容的 CFE 系統，我們嘗試使用基因組最小化細胞 JCVI-syn3A (Syn3A) 及其親緣關係支原體山羊支原體 (Mcap) 的裂解物來優化基於支原體細菌的 CFE 系統。為了生產支原體衍生的粗裂解物，我們基於大腸桿菌的 S30 方案系統地測試了細菌常用的方法。出乎意料的是，經過多次嘗試優化裂解液生產方法或補料緩衝液的組成，Mcap 或 Syn3A 裂解液均不支持無細胞基因表現。僅觀察到RNA適體的體外轉錄量較低。雖然我們的實驗系統旨在執行轉錄和翻譯，但我們的分析重點是 RNA。進一步的研究發現，儘管從各自的基因組中去除了可識別的核酸酶，並試圖抑制各種 CFE 製劑中的核酸酶活性，但所有裂解物中的核糖核酸酶 (RNase) 活性持續較高。另一種使用洋地黃皂苷透化支原體細胞膜的方法產生了 RNase 活性降低的裂解物，但仍無法支持無細胞基因表現。我們發現完整的支原體細胞透過降解核醣體RNA而使大腸桿菌無細胞萃取物中毒，這表明支原體細胞，即使是最小的細胞，也具有表面相關的RNase活性。然而，尚不清楚哪個基因編碼 RNase。這項工作總結了生產基於支原體的 CFE 的嘗試，並對進入該領域的研究人員起到了警示作用。